Зерттеулердің молекулалы-генетикалық әдістері және олардың медицина мен фармацияда қолданылуы.

Зерттеудің молекулалық-генетикалық әдістері және оларды медицинада қолдану. Молекулярлық-генетикалық әдістер (М-Г) молекулярлық-генетикалық әдістер — ДНҚ учаскесінің құрылымында вариацияларды (зақымдануларды) анықтауға арналған әдістердің үлкен және әртүрлі тобы: Аллель, ген, хромосома аймағы, м-г әдістерінің негізінде молекулярлық-генетикалық әдістер (М-Г) негіздерінің бастапқы реттілігін ажыратуға дейін ДНҚ және РНҚ гендік-инженерлік манипуляциялар жатыр барлық молекулярлық-генетикалық әдістердің бастапқы кезеңі ДНҚ үлгілерін алу болып табылады геномдық ДНҚ көзі кез келген ядросы бар жасушалар болуы мүмкін. ДНК-диагностикасына арналған Материал практикада жиі қолданылады: лейкоциттер хорион фибробласттардың амниотикалық жасушалары шаш, тырнақ, сілекей жеңіл қол жетімді биологиялық материал саны аз молекулалық-генетикалық талдау жүргізу мүмкіндігі осы топ әдістерінің әдістемелік артықшылығы болып табылады. ДНК-диагностикаға арналған Материал бір талдау үшін бірнеше нанограммадан бірнеше ДНК микрограммасына дейін болуы қажет (қолданылатын әдістерге байланысты). Ол үшін шын мәнінде биологиялық материалдың аз мөлшері талап етіледі: 20-40 мг хорион, 1 мл қан, 5-10 мг жасушалар дақылы белгілі бір әдістерді жүзеге асыру үшін ДНК-диагностикасына арналған Материал жеткілікті: 1 тамшы эпителий қыртысы бірнеше түкті баданалар және т. б. М-г әдістерін жүргізу үшін бастапқы шарттар молекулалық-генетикалық зертхананы жабдықтау тиісті зертханаларда зерттеу материалдарын арнайы дайындау ДНК (немесе РНК) үлгілерін алу — барлық әдістердің бастапқы кезеңі. Бұл кезең екі нұсқада жүзеге асырылады: а) жасушалардан барлық ДНҚ (тотальды немесе геномдық) бөлінуі; б) полимеразды тізбекті реакцияның көмегімен талдау болжанатын белгілі бір фрагменттердің жиналуы. Рестрикция

Фрагменттерге ДНҚ рестрикциясы молекулалық-генетикалық диагностикадағы қажетті кезең болып табылады. Бұл процесс бактериялық эндонуклеаз тобына жататын #рестриктаздармен жүзеге асырылады. Адам генетикасында бірнеше ондаған түрлі рестриктаз қолданылады. Рестриктазаның негізгі қасиеті рестриктаз-4-6 жұп негіздегі нуклеотидтердің тізбегінің әрбір фрагменті үшін қатаң анықталған шегінде екі нүктелі ДНҚ-ны ыдырату (сирек көп). Геномдық ДНҚ рестриктазамен өңдегенде осы фермент үшін әртүрлі ұзындықтағы фрагменттер жиынтығы алынады. ДНҚ фрагменттерінің электрофорезі ДНҚ фрагменттерінің электрофорезі осы фрагменттердің оларды агарозды немесе полиакриламидті гельдің бетінде бөлу кезінде бөлінуін қамтамасыз етеді. ДНҚ фрагменттерінің электрофорезі ДНҚ фрагменттері тұрақты электр өрісіне орналастырылған гельде, теріс полюстен өлшемдерге байланысты оң полюске қарай қозғалады (фрагменттің салыстырмалы молекулалық массасы неғұрлым көп болса, соғұрлым электр өрісінде баяу қозғалады). ДНҚ фрагменттерінің электрофорезі электрофорез аяқталғаннан кейін ДНҚ фрагментінің әрбір фрагменті нақты жерде дискретті жолақ түрінде белгілі бір орынға ие болады. Әрбір фрагменттің ұзындығын фрагментпен өткен қашықтықты белгілі өлшемдермен стандартты ДНК үлгісімен өткен қашықтықпен салыстыру арқылы анықтауға болады. Тұқым қуалайтын аурулар: мутацияларды тікелей диагностикалау әдістері мутацияларды тікелей диагностикалау бірнеше әдістерден тұрады: нуклеотидті бірізділікті анықтау (секвенирлеу); рестрикция орнының бұзылуын анықтау; синтетикалық олигонуклеотидті зондтармен аллельспецификалық гибридизацияны; негіздердің дұрыс қосылмаған жерлерінде ДНҚ химиялық және ферментативті ыдыратуды; ДНҚ мутантты молекулаларының электрофоретикалық қозғалғыштығының өзгеруін тіркеуді; in vitro ақуыз өнімін таратуды. Нуклеотидті бірізділік әдісі нуклеотидті бірізділікті анықтау жолымен патологиялық мутацияларды тікелей диагностикалау ең дәл әдіс болып табылады. Зерттелетін фрагменттің барлық бойына негіздерді ауыстыру, ендірме делециясы дұрыс анықтауға мүмкіндік береді. Нуклеотидтік реттілік әдісі әдіс кемшіліктері: секвенирлеудің еңбек сыйымдылығы жоғары құн , бұл мутациялардың тура детерациясының осы нұсқасын қолдануды ішінара шектейді. Перспективалар: секвенирлеуді автоматтандыруды дамыту болашақта бұл әдіс тұқым қуалайтын патологияның диагностикасында жетекші орын алады деп үміттенуге мүмкіндік береді. Рестрикцияның бұзылуы бойынша мутацияларды анықтау әдісі рестрикция орнының бұзылуын анықтау Саузерн бойынша блот-Гибридизация көмегімен жүзеге асырылады . Тиісті рестриктазамен өңдеу кезінде гелде қалыпты индивидтерде анықталған ДНҚ фрагменті жоқ. Нуклеотидті алмасулардың шамамен 50% — ы рестрикция орнының (немесе сайттың) өзгеруіне әкеледі, соның арқасында рестриктік талдау негізінде мутацияның тікелей детерациясы мүмкін. Олигонуклеотидті зондтармен Аллельспецификалық будандау геномдық ДНҚ мутацияларды анықтауға мүмкіндік береді олигонуклеотидті зондтағы негіздердің дәйектілігі геннің қалыпты немесе патологиялық нұсқасы бойынша берілуі мүмкін, содан кейін де белгіленеді және басқа жағдайда мұндай зонд зерттелетін индивидтің ДНҚ фрагменті бар будандау үшін пайдаланылады. ДНҚ ыдырауы бойынша мутацияларды анықтау әдісі ДНҚ тұрақсыздығына әкелетін мутациялардың үлкен тобын анықтайды. ДНҚ молекуласындағы мутациялар ДНҚ фрагментінің электрофоретикалық қозғалуын өзгерте алады. ДНҚ ыдырауы бойынша мутацияларды анықтау әдісі біріншіден, екі нүктелі фрагменттерді балқытудың температуралық көрсеткіштері өзгеруі мүмкін, бұл градиентті денатурациялаушы гельде (денатурациялаушы гель-электрофорез деп аталатын) екі нүктелі ДНҚ электрофорезінің көмегімен анықтауға болады. Екіншіден, мутация нәтижесінде бір тізбекті фрагменттердің конформациясы өзгереді, бұл ДБ анықталады.

Трансляция өнімі электрофорез арқылы талданады. Ақуыздың электрофоретикалық қозғалуының өзгеруі мутацияның бар екендігін көрсетеді (нонсенс — мутация, РНК сплайсингінің бұзылуы, оқу шеңберінің ауысуы). Мутацияларды жанама анықтау әдістері мутацияларды жанама анықтау мынадай жағдайларда қолданылады: геннің нуклеотидті бірізділігі әлі белгісіз, сонымен бірге геннің генетикалық картадағы салыстырмалы жағдайы туралы ақпарат бар. Бұл гендерді тіркеу әдісі арқылы диагностикаға сәйкес келеді мутацияларды анықтаудың жанама әдістері жанама диагностикадағы техникалық әдістер тікелей диагностикадағы сияқты: ДНҚ алу, рестрикция, электрофорез және т. б.сияқты. Зақымданған туысқандары болмаған жағдайда, тексеру үшін қол жетімді диагностика жүргізу мүмкін емес. Мутацияларды анықтау үшін жанама тәсілдерді қолдану ДНҚ полиморфты локустарының геномында болуы арқасында мүмкін болды. Нуклеотидті ауыстыру ДНҚ-ның сіңірмейтін учаскелерінде жиі кездеседі. Нуклеотидтердің айтарлықтай саны рестрикция суретінің өзгеруіне әкеледі. Рестриктік фрагменттер ұзындығының полиформизмін (ПДРФ) өзгерістің мутациясын анықтау үшін Саузерн бойынша блот-Гибридизация көмегімен анықтауға болады, өйткені рестриктік фрагменттердің ұзындығы өзгереді. ДНҚ полиморфизмінің бұл түрі рестриктік фрагменттердің (ПДРФ) ұзындығы бойынша полиформизм деп аталды. Зерттелетін геннің жанында немесе оның ішінде орналасқан полиморфты сайт осы геннің аллельді нұсқаларының маркері, соның ішінде патологиялық мутациялардың маркері бола алады.

Адам геномының мағынасын ашу ХХ ғасырдың нағыз серпілісіне айналды: әлем «код» салынған » Код » біздің әрқайсымызға қалай әсер ететінін білді. Ғалымдар осы тақырыптың төңірегінде әлі күнге дейін дау-дамайларды жүргізсін, біз көпжылдық зерттеулердің нәтижелерін бағалай аламыз: кез келген адамға молекулалық-генетикалық диагностика қолжетімді болды. Жеке кодыңызды қалай білуге болады және бұл не үшін қажет? Бұл туралы біз осы мақалада айтамыз. Молекулалық-генетикалық диагностика дегеніміз не, молекулалық-генетикалық диагностика — ағзаны тексерудің салыстырмалы жаңа әдісі, ол вирустар мен инфекцияларды, патологияны тудыратын гендердің мутациясын дәл және тез анықтауға, тұқым қуалайтын және басқа да аурулардың тәуекелдерін бағалауға мүмкіндік береді. Және бұл ДНҚ зерттеудің толық спектрі емес. Молекулалық-генетикалық диагностиканың маңызды артықшылығы in vitro-ды жүргізетіндіктен медициналық араласудың ең төменгі дәрежесі болып табылады. Әдіс эмбриондарда, сондай-ақ әлсіз және ауыр науқастарда ауруларды диагностикалау үшін де табысты қолданылады. Зерттеуге арналған ең көп таралған материал-Венадан алынған қан, бірақ басқа сұйықтықтар мен тіндерден ДНК/РНК бөлінуі мүмкін: сілекей, ауыз шырышты қабығы, жыныс мүшелерінен бөлінулер, ұрық жанындағы сұйықтық, шаш, тырнақ және т.б. Молекулалық диагностика — дербестендірілген медицинаға маңызды қадам, ол зерттеу және емдеу кезінде нақты пациенттің барлық ерекшеліктерін ескеруге мүмкіндік береді. Молекулалық диагностика әдістерін медициналық қолдану салалары сонымен, ДНҚ/РНК зерттеу медицинаның көптеген бөлімдерінде қолданылады. Молекулалық диагностиканы белсенді қолданатын міндеттер мен салаларды қарастырайық: бар патологияларды анықтау. Мысалы, молекулалық диагностикаға инфекциялық немесе вирустық ауру әдеттегі әдістермен Анықталмайтын жағдайларда қолданады. Ол сыртқы көріністер болмаған кезде тіпті ерте кезеңде ауруды анықтауға мүмкіндік береді. Аллергиялық реакцияларды зерттеу. Молекулалық диагностика аллергияны анықтау үшін табысты қолданылады: дәстүрлі әдістерге қарағанда, ол дәлірек және бұл ретте пациент үшін қауіпсіз, өйткені аллергиямен тікелей байланыс жоқ. Тұқым қуалайтын аурулардың даму тәуекелдерін жеке бағалау. Молекулалық диагностика ересектер мен балаларда болашақта әртүрлі патологияларға ұшырайтын қауіпті анықтауға көмектеседі. Айта кету керек, геннің мутациясынан (моногенді) және генетикалық ерекшеліктерден (мультифакторлы) туындаған аурулар бар. Біріншіден туралы ақпарат, мысалы, тұқым қуалайтын аурулардың ата-аналардан балаға берілу қаупін бағалауға мүмкіндік береді. Мультифакторлық патологияға бейімділік туралы білім өмір салтын өзгерту арқылы аурулардың алдын алу үшін де қажет. Перинаталдық медицина. Молекулалық диагностика адамның денсаулығы мен генетикалық бейімділігі туралы ақпарат бере алады. Бұл эмбриондарға да қатысты: әлі туылмаған баланың ДНҚ талдауы Даун, Эдвардс, Патау, Тернер, Клайнфельтер синдромдарын тануға мүмкіндік береді. Сонымен қатар, Молекулалық диагностика қосалқы репродуктивті технологиялар саласында қолданылады: ол бедеуліктің және жүктілікті көтермеудің генетикалық себептерін анықтауға мүмкіндік береді. Фармакогенетикасы. Молекулалық диагностика кейбір препараттарға неге әсер ететінін, ал басқа препараттарға — басқаларды түсіндіреді: пациенттердің генетикалық ерекшеліктеріндегі барлық іс. Заттардың тиімділігін анықтау мүмкіндігі ауыр ауруларды, мысалы, онкологиялық ауруларды емдеуде ерекше маңызға ие. Спорттық медицина. ДНҚ және РНҚ-ны зерттеудің нағыз кереметтері спорттық перспективаларды бағалау саласында да жасалады. Мысалы, балалардың ата-аналары балаға қандай сабақ түрі денсаулық үшін үлкен пайда әкелетіні немесе спорттық нәтижелерге қол жеткізуге мүмкіндік беретіні туралы біле алады. АҚШ-та дәрі-дәрмектің жанама әсерлері ауруханаға жатқызу мен өлімнің ең көп таралған себептерінің бестігіне кіреді, ал АЖӨ жою емнің өзіне қарағанда қымбатқа түседі. Дәрігерлер молекулалық диагностикаға үлкен үміт артады: әр адамның генетикалық ерекшеліктерін ескере отырып, препараттарды жеке таңдау (дербестендірілген терапия) бұл проблеманы шешуге тиіс.

Генетикалық зерттеу жүргізілген кезде, пациент өз ағзасының жағдайы туралы мәлімет алуға ұмтылған жағдайларда генетикалық зерттеулерге жүгіну өзекті болып табылады. Әдетте бұл келесі жағдайларда қажет: дәл диагноз қою үшін. Мысалы, вирусты ауруды дұрыс емес анықтау немесе дер кезінде диагностикалау өте кең таралған. Дегенмен, емдеудің табысты болуы осыған байланысты; мүмкін патологиялардың алдын алу үшін. Егер пациентке жүрек-қан тамырлары ауруларының немесе обырдың жоғары қаупі туралы белгілі болса, ол тиісті шаралар қолдана алады, мысалы, зиянды әдеттерден бас тарту; емдеу тиімділігін арттыру үшін. Мысалы, онкоаурулардың терапияның көптеген нұсқалары бар. «Сынамалар мен қателер әдісімен» емдеу тактикасын таңдау қымбат уақыт пен денсаулықтың жоғалуына, ал кейде өлімге әкеп соқтырады; жеке топ баланың жоспарлануына немесе туылуына байланысты жүргізілетін ДНК зерттеулерін бөліп көрсету керек. Көбінесе ата-аналар өздерінің генетикалық үйлесімділігін зерттеу, ұрпақтардың тұқым қуалайтын ауруларының тәуекелдерін бағалау; ұрықтың жай-күйін зерттеу, синдромдар мен қауіпті патологияларды анықтау; балада ауруларды диагностикалау (және тәуекелдерді бағалау) және аллергиялық реакцияларды анықтау; қандай спорттық сабақтарды, бала үшін қандай тамақтану мен өмір салты неғұрлым пайдалы болатынын, ал одан аулақ болу керектігін анықтау; әкелікті немесе аналықты анықтау үшін зертханаға жүгінеді. Зерттеу кезеңдері молекулалық-генетикалық зерттеудің таңдалған әдісіне қарамастан, ол келесі кезеңдерді қамтиды: биоматериал алу. Жоғарыда айтылғандай, зерттеу үшін пациенттің қанын жиі пайдаланады. Алынған материалды таңбалайды және зертханаға тасымалдайды; ДНК/РНК бөліп алу; таңдалған әдіске сәйкес зерттеулер жүргізу; нәтижелерді зерделеу және түсіндіру; қорытынды беру. Молекулалық-генетикалық диагностика әдістері молекулалық цитогенетиканың әдістері цитогенетикалық талдау тұқым қуалайтын ауруларды, психикалық ауытқуларды, туа біткен даму кемістіктерін анықтауға мүмкіндік береді. Әдістің мәні-ДНК-чиптерге салынған арнайы микроматрицалардың көмегімен хромосомаларды зерттеу. Ол үшін қан үлгісінен лимфоциттер бөлінеді, содан кейін қоректік ортаға 48-72 сағатқа салып, осы уақыт өткеннен кейін зерттеледі. Мұндай талдауды жиі тағайындайды, негізінен бедеуліктің және жүктілікті көтермеудің себептерін зерттеу үшін, туа біткен ауруларға күдікті балалардағы диагнозды анықтау үшін. Талдау өте дәл, бірақ жеткілікті еңбек сыйымдылығы және ұзақ (нәтижені тапсырудан кейін 20-30 күннен кейін ғана алуға болады). Оның ерекшелігі: цитогенетика патологиялардың аз мөлшерін ғана анықтай алады (мысалы, аутизм), алайда оны іс жүзінде қателерсіз етеді. ПТР әдісімен Молекулалық диагностика полимеразды тізбекті реакция-1983 жылы ойлап тапқан әдіс, қазіргі күнге дейін молекулалық диагностикадағы ең танымал және іргелі. Жоғары дәлдікпен және сезімталдықпен, сондай-ақ зерттеу жүргізу жылдамдығымен сипатталады. ПТР әдісімен ДНК/РНК молекулалық диагностикасы АИТВ, вирустық гепатиттер, жыныстық жолмен берілетін инфекциялар, туберкулез, боррелиоз, энцефалит және т.б. сияқты патологияларды анықтауға мүмкіндік береді. Талдау үшін ДНҚ учаскесін таңдап, арнайы заттардың көмегімен зертханада бірнеше рет қайталайды. Осы молекулалық әдіспен флуоресцентті гибридизациялау әдісі (FISH) зерттеудің объектісі болып жеке алынған хромосоманың бірегей нуклеотидті қосылыстары немесе оның учаскесі табылады. Ол үшін флуоресцентті маркерлермен таңбаланған қысқа ДНК-реттілік (зондтар) қолданылады, олар типтік гендері бар фрагменттерді анықтауға мүмкіндік береді. Талдау үшін Биоматериал кез келген болуы мүмкін: қан, сүйек миы, плацента, эмбрион тіндері, биопсия және т.б. үлгіні алғаннан кейін бірден зертханаға жеткізу маңызды. Әдіс әсіресе онкологияда (мысалы, химиотерапиядан кейін қалған қатерлі жасушаларды бақылау үшін), сондай-ақ пренаталды диагностикада (ұрықтың туа біткен кемістіктерінің даму қаупін анықтау үшін), гематологияда белсенді қолданылады. FISH — әдіс ДНҚ зақымдалған фрагменттерін анықтау үшін өте сезімтал және дәл (0,5%-ға жуық қателік), бұл ретте өте жылдам: нәтиже 72 сағаттан аспауы керек. Алайда, оның кемшіліктері де бар: FISH микроматриялық цитогенетикалық талдауға қарағанда анағұрлым ерекше және болжамды диагнозды растау немесе теріске шығару үшін ғана қызмет ете алады. Микрочипирование бұл әдіс алдыңғы әдіске ұқсас — ДНҚ реттілігінің қылқан жапырақты флуоресценті қолданылады. Алайда бұл зондтар алдымен пациенттен алынған сынамалардан бөлініп, содан кейін микрочиптерге салынған үлгілермен салыстырады. ДНК-микрочип негізі болып табылады (шыны, пластик, гельді), оған ұзындығы 25-тен 1000 нуклеотидтерге дейін бірнеше мың микротестерге дейін қолданылуы мүмкін. Биоматериалды тазартқаннан кейін алынған сынамалар (зондтар) чиптегі микротестермен біріктіріледі және маркерлердің реакциясын бақылайды. Зерттеу нәтижелері материалды алғаннан кейін 4-6 күннен кейін дайын. Талдау үшін ДНК/РНК үлгісін алуға болатын кез келген биоматериал қолданылады. Онкология және кардиологияда мұндай әдісті (оның ішінде генетикалық бейімділікті зерттеу үшін) қолданады, ол дәл және сезімтал, бірақ Ресейде сирек қолданылады-бұл оның басты минус. Сонымен, Молекулалық диагностика-медицинаның түрлі салаларында кең спектрмен денені тексерудің инвазивті және дәл әдісі. Егер батыста ДНК/РНК зерттеулері барлық жерде таралған болса, Ресейде мұндай қызметті барлық клиникалар ұсынбайды. Аурулардың молекулалық диагностикасын қайда өтуге болады? Молекулалық диагностиканы көбінесе жеке клиникалар мен зертханаларда жүргізеді. Бірақ коммерциялық медициналық орталықтар арасында қызмет әлі күнге дейін өте таралған емес, өйткені қымбат шетелдік жабдықтар мен жоғары білікті мамандар-генетиктерді талап етеді. «ИНВИТРО» тәуелсіз зертханасының маманы өз түсініктемесін береді: «ДНҚ — ны зерттеудің қолданылатын әдістеріне байланысты-олардың кейбіреулері жеткілікті дәрежеде дәл емес, басқалары өте қымбат. Біз» ИНВИТРОДА «молекулалық диагностиканың» алтын стандарты » деп аталатын ПТР әдісін қолданамыз. Ол репродуктивті функцияны, нашақорлық пен алкоголизмнің даму тәуекелдерін, жүрек-қан тамырлары, онкологиялық ауруларды, АІЖ, ОЖЖ патологияларын, метаболизм мен қанның ұюының бұзылуын бағалауды жүргізуге, кең таралған дәрілік препараттардың әсеріне жеке реакцияларды анықтауға мүмкіндік береді. Зерттелетін материал ретінде қан шығады. Талдау ерекше дайындықты талап етпейді, жалғыз Елеулі шектеу: биоматериалды тапсырар алдында бір ай ішінде антибиотиктерді қабылдаудан бас тарту керек».

Басқа да ұқсас мәліметтер

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *